28.06.2012

От чего зависит окраска трансгенных (ТГ) и (GloFish) аквариумных рыб?

Впервые генетически модифицированные рыбки (трансгенные данио рерио и медака) появились в продаже в 2003 г. сначала на Тайване и в других азиатских странах, затем в США. А в 2005 г. их и в России было уже немало. Официальные производители этих рыб - тайваньская корпорация Тайконг (производит и продаёт флуоресцирующих рыбок ТК-1, TK-2, ТК-3) и американская компания Yorktown Technologies LP (продаёт в США рыбок под торговой маркой GloFish). Спрос рождает предложение, а слухи о том, что все поступающие в продажу трансгенные рыбы бесплодны, не подтвердились, и вот теперь их успешно разводят в России и на Украине, да, наверное, и в других странах тоже.

Как получаются ТГ рыбки иных цветов (не красные и не зеленые)? Оранжевых рыбок создали, скрестив ТГ носителей rfp-гена и gfp-гена. У гибридов в мышечной ткани имеет место экспрессия обоих генов (это "дважды трансгенные" рыбы), причем красного белка синтезируется больше, вот мы и воспринимаем их цвет как оранжевый. Одни и те же ТГ рыбки выглядят при дневном освещении и при освещении ультрафиолетом по-разному. При дневном освещении мы воспринимаем их цвет главным образом посредством отраженных лучей. В этих условиях оранжевая рыбка, цвет которой получен смешением двух красителей (gfp и rfp), выглядит несколько более темной, так как наблюдается эффект вычитательного, или субтрактивного смешивания цветов, поскольку каждый краситель поглощает свою часть спектра. При этом на цвет рыбки оказывают влияние еще и расположенные в коже хроматофоры. То же самое происходит на палитре художника, когда он смешивает краски. Совсем иначе обстоит дело при освещении рыбок ультрафиолетом. Тут вклад флуоресценции в создание зрительного образа очень велик, поэтому рыбки воспринимаются как самосветящиеся объекты. Оранжевая рыбка выглядит светлее красной и зеленой, так как в её мышцах светятся и rfp (его столько же, сколько в красной рыбе), и gfp (а это еще примерно 15%-ая добавка к свечению). В этом случае происходит аддитивное, или слагательное смешение цветов. При дневном освещении gfp и rfp больше похожи на простые краски и смешиваются также, как они, а под ультрафиолетом gfp и rfp начинают флуоресцировать и смешиваются, уже как красный и зеленый лучи света.

Флуоресцентные рыбы Данио рерио были специально выведены с целью обнаружения загрязнителей окружающей среды. Уже более десяти лет флуоресцентные рыбы используются учеными по всему миру, чтобы решать важные проблемы в области генетики и молекулярной биологии. В США исходно светящиеся данио были получены с целью создания живых индикаторов загрязнения - при наличии в воде определённых токсических веществ рыбки должны были изменять окраску.

GloFish являются генномодифицированной формой весьма популярной аквариумной рыбки данио-зебра. В естественном виде эти рыбки имеют чёрный или серебристый цвет. В отличие от них GloFish окрашены в красный, да к тому же испускают лёгкое красноватое свечение, которое наиболее заметно при освещении ультрафиолетом. Такой необычный метаморфоз произошел благодаря введению в ДНК данио-зебра гена красной окраски, заимствованного у морской актинии. Оказалось, что данио рерио как нельзя лучше подходят для экспериментов с GFP- и RFP-трансгенами. Созданы многочисленные чистые генетические линии этих рыб, строго наследующие определенные признаки. Применительно к рассматриваемой нами теме, данио оказались обладателями еще одной особенности: их эмбрионы быстро развиваются и долгое время остаются почти прозрачными. Да и взрослые рыбы с ослабленной пигментацией в немалой степени сохраняют это свойство. Поэтому, если организм трансгенной рыбы приобретёт способность производить флуоресцентный белок, то свечение легко будет наблюдать даже в том случае, когда экспрессия встроенного в её геном гена будет происходить в тканях, расположенных под кожей и во внутренних органах. Сходными свойствами обладает и японская рисовая рыбка – медака (Orizias latipes). Тайваньские и японские исследователи много экспериментировали с этим видом. В итоге в настоящее время мы имеем флуоресцирующих и медак, и данио. Но кроме генетически модифицированных данио рерио, медаки, атлантического лосося разводят также ГМ карпов, ГМ форель, ГМ тиляпию, ГМ канальных сомиков, ГМ золотых рыбок. И наверняка еще кого-нибудь... Словом, трансгенные аквариумные рыбки - это всего лишь вершина айсберга, большая часть которого скрыта от наших глаз.

Сначала из морских медуз (Aequorea victoria) и анемонов (Discosoma sp.) были выделены гены, кодирующие зеленые (green fluorescent protein, или GFP) и красные флюоресцирующие белки (red fluorescent protein, или RFP), а затем ученые научились встраивать эти гены в геном рыб таким образом, что синтез флюоресцирующих белков запускался именно тогда, когда в ходе индивидуального развития эмбрионов данио начинали формироваться те или иные группы мышц. Процесс формирования мышечной системы стало возможным увидеть в красках под флуоресцентным микроскопом. Способность белков светиться под мягким ультрафиолетом позволяла обнаруживать их и, соответственно, мышечную ткань, в которой они синтезировались, на очень ранних стадиях развития. Оказалось, что в мышцах рыб эти флюоресцирующие белки синтезируются потом всю жизнь. Они накапливаются в таком количестве, что становятся заметными невооруженным глазом. Рыбка окрашивается в цвет того флуоресцентного белка, который синтезирует и в итоге, по мере взросления, она делается все ярче и ярче! Подрастая, генетически модифицированные данио становятся пронзительно красными или зелеными. В настоящее время подобных генов известно уже около десятка.

Результаты предварительного эксперимента, поставленного проф. Гонгом для выяснения того, какие окраски можно в принципе получить, используя зеленый и красный флуоресцентные белки

Эти белки были экстрагированы из мышц ТГ рыб и смешаны в различных пропорциях. В зависимости от доли того или иного белка в смеси получаются различные цвета. Однако общий принцип регуляции известен: нужное количество флуоресцентных белков в мышечной ткани получают, изменяя силу промоторов, то есть их способность обеспечивать экспрессию генов-репортеров. В итоге одного окрашивающего рыбу белка синтезируется больше, а другого меньше, что обеспечивает получение определенного результирующего цвета. Цвет рыбок, способных синтезировать в своих мышцах красный флюоресцирующий белок, на самом деле может быть очень разным. В основном это зависит от цвета их кожных покровов, которые частично экранируют световые лучи, отражаемые окрашенной мускулатурой рыб или испускаемые ею при флюоресценции во время освещения синими и ультрафиолетовыми лучами. В настоящее время существует множество цветовых форм обычных немодифицированных данио, так называемых бекграунд линий (background line). Эти линии были использованы для получения трансгенных данио различных цветовых оттенков. При этом применялись методы классической селекционной работы, а не генной инженерии (гены, ответственные за синтез цветных белков, проявляют себя как доминантные, и их наследование происходит согласно классическим законам Менделя). Есть, к примеру, рыбы-альбиносы, которые полностью лишены способности синтезировать черный пигмент (меланин) в своем организме. У них кожа очень светлая и прозрачная, поэтому, если в их геноме окажется ген, ответственный за синтез красного флюоресцирующего белка, то розово-красная окраска мышц будет у них видна очень хорошо. И эти рыбки действительно выглядят максимально ярко. А вот рыбки, окрас кожи которых приближается к дикому типу, заметно темнее, так как зерна меланина экранируют собой цвет мышц.

Следует отметить, что при создании устойчивых линий ТГ рыб разных цветов и оттенков, стабильно передающих свои свойства потомкам, на первый план выходит классическая селекционная работа. Рыб-носителей трансгенов скрещивают с представителями тех или иных чистых генетических линий (background line), а затем кропотливо отбирают потомство с нужными свойствами. Наследование генов, ответственных за синтез gfp и rfp, подчиняется законам Менделя, при этом указанные гены ведут себя как доминантные. Цвет рыбок, способных синтезировать в своих мышцах красный флюоресцирующий белок, на самом деле может быть очень разным. В основном это зависит от цвета их кожных покровов, которые частично экранируют световые лучи, отражаемые окрашенной мускулатурой рыб или испускаемые ею при флюоресценции во время освещения синими и ультрафиолетовыми лучами. В настоящее время существует множество цветовых форм обычных немодифицированных данио, так называемых бекграунд линий (background line). Эти линии были использованы для получения трансгенных данио различных цветовых оттенков. При этом применялись методы классической селекционной работы, а не генной инженерии.

Однако есть и особенные ТГ аквариумные рыбы, способ получения которых держится в тайне, и можно только гадать о том, как они были получены. Это творения корпорации Тайконг – рыбы известные как TK-3 (Candycane). "Фирма-изготовитель" лишь указывает, что рыбы синтезируют gfp и rfp под управлением "актинового" промотра, но как добились такого неестественного распределения флуоресцентных белков? Согласно одной из гипотез, эти рыбки составлены из двух разрезанных пополам ТГ эмбрионов, один из которых обладал gfp-, а другой rfp-генами. К передней части туловища одного прирастили заднюю другого. Если операцию провести на ранних стадиях развития эмбриона, то успешное сращивание половинок вполне возможно. Словом, это результат виртуозной ручной работы. Недаром в широкой продаже этих ТГ рыб пока нет. Тайваньские исследователи не удовлетворились "естественной" притягательностью "водных зебр" и решили ее усовершенствовать. В наследственный аппарат популярной во всем мире декоративной рыбки Данио-рерио ученые Тайваньской биотехнологической фирмы Taikong Corporation встроили специфический ген, которым природа наделила лишь некоторых тихоокеанских медуз. Этот ген несет ответственность за синтез белка люминофора, который в темноте испускает лучи приятного зеленоватого цвета. Сначала целью генных инженеров было облегчить наблюдение за внутренними органами этих полупрозрачных рыбешек. Но фотографию светящейся зеленоватым призрачным светом рыбки, показанную на научной конференции, увидел представитель компании, занимающейся разведением и продажей аквариумных рыб. По заказу фирмы в геном данио добавили еще ген красного свечения, выделенный из морского коралла. В результате они порадовали аквариумистов новой "забавой" - рыбкой с флуоресцирующим зеленым светом. Трансгенным рыбкам с пересаженным геном медузы было дано поэтическое название "Night Pearl" (Ночная Жемчужина).

Существует некоторая озабоченность по поводу того, что может произойти, если эти генетически измененные рыбы попадут в естественные реки и ручьи. Создатели GloFish утверждают, что они не представляют экологическую угрозу, поскольку не смогут выжить в дикой природе, так как они являются тропическими рыбами и им нужна температура воды около 24-26°С.

Давайте сравним, чем отличается естественная окраска рыб, данная природой, от окраски генетически модифицированных данио? Ответив на этот вопрос, можно будет легко понять, были ли волнения защитников окружающей среды относительно возможности попадания трансгенных данио в природные биотопы обоснованными? Легко заметить, что естественная природная окраска рыб зависит от того, как на них падает свет. Эти рыбы выглядят яркими, только если они освещены фронтально и мы видим их в отраженном свете. В проходящем свете они становятся совсем бледными, а если свет падает на них под разными углами, то рыбки дают яркие блики. Кроме того, природная окраска как бы расчленяет тело рыбок, разбивает его на отдельные фрагменты, сходные с элементами окружающей среды и бликами на поверхности. Такая окраска сформировалась в ходе эволюции неспроста: она выполняет функцию маскировки рыбки от хищников. Трансгенные же рыбы всегда остаются яркими. Они отлично видны со дна на фоне голубого неба и листвы. А именно снизу атакует свои жертвы большинство водных хищников. Но они отлично видны и сверху и будут легкой добычей хищных птиц. При падении уровня освещения, рыбки природной расцветки сереют и делаются почти незаметными для глаза, а трансгенных рыб с головой выдает флуоресцентная составляющая их окраски. Более того, яркий розово-оранжевый цвет вызывает атаку даже сытого хищника и раздражает не очень-то хищных, но просто достаточно крупных рыб. Словом, выжить в природе у трансгенных данио нет ни единого шанса - на этот счет можно не волноваться. Следует отметить, что съев трансгенную рыбку, хищник легко ее переварит, точно также как и любую другую свою жертву. Флюоресцирующие белки не токсичны и полностью расщепляются пищеварительными ферментами. Таким образом, от генетически модифицированного данио в природном водоеме вскоре не останется и следа.

Содержание флуоресцирующих рыбок

Рыба рождается с этим уникальным цветом и сохраняет цвет на протяжении всей своей жизни. Цвет также передается потомкам. Каковы различия между флуоресцентными рыбами и другими видами Данио рерио? Помимо своих флуоресцентных цветов, они такие же, как другие рыбы, во всех отношениях. Поведение модифицированных данюшек остается таким же непоседливым, как и у их прародителей. Они явно тяготеют к верхним слоям воды, где предпочитают держаться в струе от помпы. Рыбки сохраняют миролюбивость своих предков, что позволяет содержать их в компании таких же маленьких и шустрых аквариумных рыб. Рыбка, по условиям содержания, ничем не отличается от исходного вида - Данио рерио - неприхотливая, стайная и подвижная рыбка для верхних слоев воды в декоративном аквариуме, теперь и ярко окрашенная. Медицинская помощь, температура содержания, темпы роста, продолжительность жизни и уход за ними идентичны. Они достигают размера приблизительно 5 см. Они всеядные. Размножение у них такое же, как у Данио рерио. В отличие от Данио рерио, самки и самцы GloFish имеют практически одинаковый цвет, и поэтому их различают по форме тела. Определение пола трудно у рыбной молоди. Взрослые самцы имеют обтекаемую форму, а у взрослых самок полное "брюхо" как у самки Данио рерио. Даже в аквариуме компанию для трансгенных данюшек надо подбирать вдумчиво. Они легко уживаются с такими лабиринтовыми рыбами как петушки и лялиусы, со многими живородящими рыбками, но цихлиды, даже маленькие, скорее всего, будут пытаться поймать их. И, конечно же, модифицированные Данио рерио смогут жить вместе с другими рыбами рода Данио и близких родов.

Флуоресцентная рыба сперва поглощает свет, а затем начинает излучать ее. Это создает впечатление, что они светящиеся, особенно когда ультрафиолетовый свет направлен на рыбу в темной комнате. В дневное время традиционный белый свет аквариума (например, лампы дневного света или галогенной лампы) идеально подходит для использования в дневное время. Потому, что флуоресцентные рыбы поглощают свет и вновь излучают его, цвета рыб становятся более яркими и живыми. Использование белого гравия будет способствовать дальнейшему углублению цвета рыб.

В ночное время, когда в комнате совершенно темно, свет создаст впечатление, что рыбы светятся в темноте. Это действительно потрясающий и красивый способ показать ваших декоративных рыб ночью! Но помните, что отраженный флуоресцирующий свет может быть только в совершенно темной комнате. Использование флуоресцентного света в дневное время не приведет к демонстрации рыбой свою истинной красоты.

Чем освещать аквариум со "светящимися" рыбами?

Итак, флуоресцирующие рыбки - теперь объективная реальность нашей аквариумистики. В настоящее время в продаже появились специальные светильники, которые, создавая эффект сумеречного освещения, вызывают яркую флюоресценцию трансгенных рыб, и множество искусственных украшений, которые тоже светятся в соответствующих условиях. На Тайване, в Китае и в странах Юго-Восточной Азии создание загадочно мерцающих в полумраке аквариумов уже давно вошло в моду. Все чаще можно встретить такое оформление комнатных водоемов и у нас. Можно серьезно говорить о том, что складывается новое направление в аквариумном дизайне. Не надо обладать даром предвидеть будущее, чтобы предсказать, что споров вокруг флуоресцирующих рыбок будет гораздо больше, чем вокруг красных попугаев, наверняка, возникнет огромная армия их противников, но найдется и немало поклонников этой "неземной" красоты.

Только представьте, вы приходите домой после трудного рабочего дня, выключаете свет и любуетесь ярко светящимися в темноте рыбками. Однако флуоресцирующие рыбки самопроизвольно не светятся. Для того чтобы наблюдать свечение аккумулированных в их мышечной ткани особых белков (gfp и/или rfp), их необходимо освещать синим, а еще лучше ультрафиолетовым светом. В полной темноте без ультрафиолетового облучения ничего видно не будет, поскольку флуоресцентные белки в их теле излучают свет только под воздействием внешнего светового потока, постольку окраска рыб непосредственно связана со способом освещения аквариума. И тут многое начинает зависеть не только от того, как много флуоресцентного белка имеется в мышцах, но и от количества, функционального состояния и качественного состава пигментных клеток (хроматофоров), расположенных в коже рыбки.

Влияние освещения аквариума на окраску трансгенных рыб

Воспринимаемая нами окраска рыб, как впрочем, и любых других окружающих нас предметов, - это своего рода "игра разума", красивый фокус, который показывает нам наш мозг. Дело в том, что в соответствии с законами оптического смешения цветов мы видим каждую точку рассматриваемого объекта только в каком-нибудь одном цвете, несмотря на то что на самом деле она посылает множество лучей различной длины волны в наш глаз. Эти лучи могут быть отраженными, а могут испускаться рассматриваемым объектом (в этом случае говорят, что объект самосветящийся). При освещении белым светом мы видим рыб в основном посредством отраженных лучей. Вклад флуоресцентной составляющей (свечения) в формирование зрительного образа возрастает с увеличением доли синих лучей при освещении рыб. Под ультрафиолетом они предстают перед нами как светящиеся объекты. Окраска данио рерио дикого типа воспринимается нами посредством отраженных лучей. В коже рыбы имеется несколько типов отражающих и светопреломляющих элементов, влияющих на её цвет: меланофоры содержат пигментные зерна черного цвета (они ничего не отражают, а только поглощают), красные эритрофоры и желтые ксантофоры (отражают соответственно красные и желтые лучи, остальные поглощают) и бесцветные гуанофоры, содержащие светопреломляющие кристаллы гуанина, которые могут концентрироваться или распределяться по клетке. Светопреломление в гуанофорах, в зависимости от угла падения света, приводит к изменению цвета покровов рыбы от серебристо-белого до синевато-фиолетового и сине-зеленого или даже желто-красного. Гуанофоры в сочетании с ксантофорами и эритрофорами дают зеленый, а с меланофорами - синий цвет. Вот как непросто устроены синие и желтые полоски данио! Они могут почти полностью экранировать или сильно изменять наше восприятие цвета флуоресцентных белков. Поэтому ТГ рыбки, синтезирующие зеленый флуоресцирующий белок (gfp), могут выглядеть не только зелеными, но и желтыми и даже слегка голубоватыми, а синтезирующие красный (rfp) - розовыми и пурпурными.

Это рыбка-альбинос, далекие предки которой также вышли из недр корпорации Тайконг. Рыбы альбиносы, которые полностью лишены способности синтезировать черный пигмент – меланин – в своем организме. У них кожа очень светлая и прозрачная, поэтому, если в их геноме окажется ген, ответственный за синтез красного флюоресцирующего белка, то розово-красная окраска мышц будет у них видна очень хорошо. И эти рыбки действительно выглядят максимально ярко. Черный пигмент у нее совсем не синтезируется. И тут мы видим цвет красного белка, который первоначально умел синтезировать только морской анемон, в своем чистом виде, так как кожа рыбки практически прозрачна.

Источники:

1. zivnost.elitno.net
2. zoospravka.ru