28.09.2017

Отбор сперматозоидов влияет на приспособленность потомства у данио-рерио

Шведские биологи показали, что у рыбок данио-рерио сперматозоиды с разной продолжительностью активности из одной порции спермы по-разному влияют на приспособленность получающегося потомства. Икринки, оплодотворенные долгоживущими сперматозоидами, реже погибали за первые сутки, а выросшие из них рыбы обладали повышенной приспособленностью: самцы эффективнее оплодотворяли самок, а самки порождали более жизнеспособное потомство. Между сперматозоидами с разной продолжительностью жизни были обнаружены генетические различия, которые могут отвечать за обнаруженный феномен. Ранее считалось, что эффект такого отбора половых клеток у животных минимален.

Жизненный цикл большинства многоклеточных животных состоит из двух фаз, различающихся числом хромосом в клетках. В гаплоидной фазе клетки несут одиночный набор хромосом, а в диплоидной — двойной, обычно образованный при слиянии гаплоидных половых клеток родителей. Собственно, гаплоидная фаза представлена у животных именно половыми клетками (сперматозоидами и яйцеклетками). У растений же фаза с одиночным набором хромосом состоит из многих (по крайней мере, из нескольких) клеток: например, к ней относятся заростки папоротников и пыльцевые зерна семенных растений. А у мхов гаплоидная фаза даже преобладает над диплоидной: двойным набором хромосом у них содержится только в спорангиеносцах и спорангиях.

Из-за того, что гаплоидная фаза у животных одноклеточна, она не рассматривается в качестве отдельного организма. При этом если все клетки диплоидного организма с небольшими допущениями можно считать обладающими идентичным генотипом, то разные гаметы (половые клетки) одной и той же особи, имеют разную ДНК: в ходе порождающего их редукционного деления — мейоза из содержащихся в диплоидной клетке двух копий каждого гена в гамету случайным образом попадает только одна. При этом считается, что у животных естественный отбор происходит только на диплоидной стадии, а фенотипические свойства сперматозоидов определяются скорее диплоидным геномом породившего их отца, а не их собственной ДНК (см., например, S. Pitnick et al., 2009. Sperm length is not influenced by haploid gene expression in the flies Drosophila melanogaster and Scathophaga stercoraria), и не влияют на свойства потомства.

Впрочем, в последнее время появляются работы, оспаривающие это положение: было показано, что у асцидии Styela plicata более долгоживущие сперматозоиды порождают потомство с более высокой выживаемостью на ранних стадиях (A. J. Crean et al., 2012. Fertilization is not a new beginning: The relationship between sperm longevity and offspring performance), а у атлантического лосося Salmo salar сперматозоиды со средней продолжительностью активности порождают мальков, раньше вылупляющихся из икринок (S. Immler et al., 2014. Sperm variation within a single ejaculate affects offspring development in Atlantic salmon). Однако до сих пор не было работ, в которых ученые пытались бы отделить влияние старения сперматозоидов от их наследственных (генетических или эпигенетических) особенностей, а также оценить более долгосрочное влияние разнокачественности сперматозоидов внутри одного эякулята (порцию спермы, выделяемую самцом во время одного семяизвержения) на приспособленность потомства и тем самым понять, возможен ли естественный отбор на гаплоидной стадии.

Новая статья исследовательской группы Симоны Иммлер (Simone Immler) из Уппсальского университета, опубликованная в журнале PNAS, восполнила этот пробел. Ученые работали с рыбами данио-рерио (Danio rerio, стандартный модельный организм в биологических исследованиях) и показали, что в одном эякуляте сосуществуют разнокачественные когорты сперматозоидов, которые различаются по эффектам на приспособленность потомства.

У этого вида, как и у многих рыб, оплодотворение внешнее — икра (яйцеклетки) и молоки (сперма) выметываются в воду, где и происходит их встреча. Такое оплодотворение можно провести и «в пробирке». Так как сперматозоиды и яйцеклетки данио-рерио активируются при контакте с водой, то, выпуская сперму к икринкам в разное время, ее легко можно разделить на коротко- и долгоживущую. Ученые проделали это, разделив сперму на две когорты: в первой (которую обозначали аббревиатурой SAT — short activation time) сперматозоидам сразу же давали возможность оплодотворить икру, во второй (LAT — long activation time) икру к сперматозоидам добавляли только после того, как 50% из них теряли подвижность. Для каждого участвующего в эксперименте самца этот момент выявлялся путем прямого наблюдения под микроскопом. При этом оказалось, что у разных самцов половина сперматозоидов теряла подвижность примерно за одно и то же время — 25 секунд, поэтому исследователи повторили опыты по упрощенному протоколу: когорту LAT составляла сперма возрастом 25 секунд после активации. Чтобы уравнять вероятность оплодотворения, в случае LAT на то же количество икры брали в два раза больше спермы. Кроме того, чтобы исключить возможное влияние эффекта старения яйцеклеток в обоих вариантах опыта использовали свежую икру, собранную не более чем за минуту до встречи со сперматозоидами.

Результаты опытов с разным способом отбора гамет (по доле сохранивших активность гамет и по времени после активации) оказались согласованы: мальки, порожденные «долгоиграющими» сперматозоидами, отличались повышенной выживаемостью в первые сутки, а взрослые самцы, выросшие из них, обладали спермой, более богатой сперматозоидами, которые, в свою очередь, были быстрее, чем у их братьев, порожденных SAT-спермой (рис. 2). Кроме того, через 8 часов после оплодотворения SAT-спермой в более чем 80% развивающихся икринок были обнаружены апоптические клетки (апоптоз — запрограммированная клеточная смерть) против 50% у LAT-спермы.

Так как два метода разделения спермы показали согласованные результаты, дальнейшие опыты проводили по более простому в исполнении протоколу с разделением спермы по времени после активации.

Исследователи оценили репродуктивный успех самцов и самок, порожденных двумя вариантами спермы, при спаривании с рыбами, не участвовавшими в эксперименте. У дочерей экспериментальных рыб не было выявлено никакого значимого эффекта ни в числе выметанных яйцеклеток, ни в успешности оплодотворения. Однако у сыновей различия были: у самцов, порожденных LAT-спермой, успешность оплодотворения была выше на 4%, а спаривающиеся с ними самки выметывали на 20% больше икринок (рис. 3, графики А и В)! Последний результат может показаться странным, однако у данио-рерио самки мечут икру в ответ на выметывание молок самцами и могут регулировать ее количество в ответ на «продуктивность» самца. У LAT-самок все-таки оказалось некоторое преимущество: их потомство лучше выживало, у самцов же различий между вариантами опыта обнаружено не было (рис. 3, С). Ну и наконец, самцы и самки, порожденные LAT-спермой, оставляли больше нормально развивающихся яиц по сравнению с рыбками, порожденными SAT-спермой (рис. 3, D). Таким образом, разные варианты сперматозоидов оказывают влияние на приспособленность и во втором поколении, однако эти эффекты проявляются в основном только у самцов. Возможно, это объясняет причину сохранения в популяции этой изменчивости.

Как уже было сказано выше, предыдущие исследования, указывавшие на разнокачественность спермы внутри эякулята, не позволяли отделить влияние свойств самих сперматозоидов от их старения. Известно, что с течением времени качество ДНК сперматозоидов падает, в них накапливаются вредные мутации, кроме того, их свойства могут меняться за счет эпигенетических механизмов — различных модификаций ДНК (см. L. C. Lindeman, 2011. Prepatterning of developmental gene expression by modified histones before zygotic genome activation).

Чтобы исключить эту возможную причину обнаруженных различий, исследователи провели две серии опытов, отсекавших возможность старения сперматозоидов до и после эякуляции. В первом эксперименте они брали несколько (две или три) последовательных порций спермы у нескольких самцов — и никакого эффекта преэякуляционного старения (то есть изменения качества сперматозоидов, пока они ждали своей очереди) на жизнеспособность потомства обнаружено не было. Чтобы проверить гипотезу о возможном постэякуляционном старении, ученые изменили концентрацию солей в воде, тем самым снизив осмотический стресс на клетки и продлив их время активности, а вместе с тем и время действия факторов, ухудшающих качество ДНК. В этом эксперименте не было обнаружено различий между выживаемостью потомков, порожденных спермой, активированной за 25 и за 50 секунд до оплодотворения. Приведя доводы в пользу того, что полученные результаты не могут быть объяснены старением сперматозоидов, авторы добавляют, что вообще-то в этом случае эффект должен бы был быть противоположным: потомство от более поздних гамет было бы менее приспособленным.

Таким образом, по мнению авторов обсуждаемой работы, их эксперименты действительно позволили разделить сперматозоиды внутри одного эякулята на две группы, различающиеся влиянием на приспособленность потомства.

Можно предложить два возможных механизма того, как отбор по времени от активации до оплодотворения может разделять сперматозоиды. Один из них состоит в том, что в SAT-сперме и в LAT-сперме в оплодотворении участвуют разные когорты половых клеток. Это может проистекать из-за отрицательной связи между скоростью движения сперматозоидов, особенно важной у организмов с внешним оплодотворением, и продолжительностью их активности — ранее это было показано на морских ежах (см. D. R. Levitan, 2000. Sperm velocity and longevity trade off each other and influence fertilization in the sea urchin Lytechinus variegatus). В этом случае в SAT-сперме в оплодотворении бы участвовали быстрые и короткоживущие гаметы, а в LAT-сперме — медленные и долгоживущие. Второй вариант состоит в том, что разделение когорт неполное: в SAT-сперме в оплодотворении участвуют и короткоживущие, и долгоживущие гаметы, в то время, как в LAT-сперме — только долгоживущие. Так как первый вариант был отвергнут на основе прямых наблюдений скорости и времени жизни отдельных сперматозоидов у нескольких самцов (эти показатели оказались не связаны), то исследователи заключили, что работает второй вариант.

Причина различий в приспособленности потомства, полученного от разных когорт сперматозоидов, может состоить как в генетических различиях между ними (за счет различий в ДНК), так и в эпигенетических (ДНК одинаковы, но некоторые участки модифицированы, например, метилированы). Авторы не исследовали возможные эпигенетические маркеры, но предоставили довод в пользу того, что различия между гаметами именно генетические.

Как было отмечено выше, организмы порождают гаметы двух типов по тем локусам (участкам ДНК), по которым они гетерозиготны (то есть несут разные варианты гена на двух копиях хромосомы): в половую клетку попадет либо один, либо другой аллель. Соответственно, отбор спермы может приводить к различию в долях некоторых генных вариантов, если их носители-сперматозоиды будут различаться по времени активности. Чтобы выявить возможные различия в аллельном составе, надо было дополнительно отделить коротко- и долгоживущие клетки. Чтобы сделать это, ученые помещали сперматозоиды в каплю воды, от центра к краям которой росла концентрация глюкозы — известно, что сперматозоиды движутся в сторону источника этого вещества. Далее ученые разделили сперматозоиды по тому, насколько они смогли продвинуться за время своей активности: так как все они двигались от центра, в центральной части капли остались короткоживущие клетки, а на периферии — долгоживущие.

Также исследователи взяли пробы ДНК из плавников (это стандартный метод взятия генетических проб у рыб) у самцов — «доноров» спермы. Это позволило выявить те локусы, по которым они гетерозиготны, а потому сперматозоиды могут нести разные аллели. Кроме того, в качестве контроля использовали интактную (не подверженную никаким экспериментальным манипуляциям — в данном случае отбору по времени активности) сперму тех же самцов.

Сравнение с плавниками и с интактной спермой не выявило возможного смещения частот аллелей, происходящего при образовании гамет (могло быть так, что некоторые из них склонны попадать в сперматозоиды чаще, чем просто случайно — так называемый мейотический дрейф) и при проведении эксперимента. Однако между долго- и короткоживущими сперматозоидами обнаружились значимые различия в частотах аллелей. Впрочем, эти результаты были получены всего на трех самцах и сами авторы очень осторожны с выводами, подчеркивая только сам факт различий в генотипах разных когорт сперматозоидов.

Продемонстрированный в обсуждаемой работе феномен (что имеющие наследственную природу различия между сперматозоидами в эякуляте одного и того же самца влияют на приспособленность потомства) говорит о том, что у животных также теоретически возможен гаплоидный отбор (хотя авторы не привели возможных механизмов его осуществления в природе). Последний хорошо известен у растений, у которых наблюдается конкуренция пыльцевых зерен за прорастание на рыльце пестика (конкурировать между собой могут и зерна пыльцы одного растения), и эволюционисты давно изучают его роль в развитии адаптаций и накоплении груза вредных мутаций (см., например, статьи D. Charlesworth, B. Charlesworth, 1992. The effects of selection in the gametophyte stage on mutational load; H. A. Orr, S. P. Otto, 1994. Does diploidy increase the rate of adaptation?). Кроме того, полагают авторы, отбор гамет сможет найти применение и в технологиях экстракорпорального оплодотворения.

Источник: Ghazal Alavioon, Cosima Hotzy, Khriezhanuo Nakhro, Sandra Rudolf, Douglas G. Scofield, Susanne Zajitschek, Alexei A. Maklakov, Simone Immler. Haploid selection within a single ejaculate increases offspring fitness // PNAS. 2017. V. 114. №30. P. 8053–8058. DOI: 10.1073/pnas.1705601114.

Сергей Лысенков

Источники:

1. elementy.ru